Découverte d’un inhibiteur BCL-XL puissant et sélectif avec activité in vivo

L’apoptose est hautement conservée

processus qui est critique pour l’homéostasie cellulaire et le développement.

Dysregulation dans la signalisation apoptotique est une exigence commune pour l’oncogenèse,

maintien de la tumeur, et chimiorésistance.1 interactions de liaison dynamique entre le pro-apoptotique (par exemple, BAX,

Protéines BAK, BAD, BIM, NOXA) et anti-apoptotiques (par exemple, BCL-2, BCL-XL, MCL-1) Les protéines de la famille BCL-2 contrôlent l’engagement dans la cellule programmée

death.2,3 BCL-2 joue un rôle dominant dans la survie

des tumeurs malignes lymphoïdes où il est fréquemment surexprimé 4, tandis que la surexpression de BCL-XL

été corrélé avec la résistance aux médicaments et la progression de la maladie de multiples

tumeurs solides et malignités hématologiques5. Cibler ces protéines par l’intermédiaire de petites molécules inhibitrices

été un objectif de longue date dans la communauté de l’oncologie.

les difficultés inhérentes à cibler les protéines et les protéines

interactions, une combinaison de résonance magnétique nucléaire (RMN)

le dépistage et la conception basée sur la structure ont permis ABT-263 (navitoclax) .6 − 8 Navitoclax est un premier-in-class, inhibiteur biodisponible oralement de

à la fois BCL-2 et BCL-XL, qui a démontré clinique

l’activité antitumorale dans les tumeurs malignes lymphoïdes qui sont censés être

dépend de BCL-2 pour la survie.9,10

avec des études précliniques montrant le rôle du BCL-XL dans

la survie des plaquettes, 11,12 thrombocytopénie était la principale

toxicité clinique limitant la dose de navitoclax lorsqu’il est administré

agent.9 Cette observation a incité la génération

de l’inhibiteur sélectif BCL-2 ABT-199,13 qui a montré une activité antileucémique dans les lymphocytes chroniques réfractaires

patients atteints de leucémie sans thrombocytopénie limitant la dose

par le traitement navitoclax. Ces données cliniques démontrent que

les inhibiteurs d’une seule protéine de la famille BCL-2 peuvent être particulièrement prometteurs

en ciblant des types de cancer spécifiques. Nous avons précédemment signalé que

la synergie observée entre navitoclax

et les chimiothérapies sont principalement motivées par l’inhibition du BCL-XL dans les tumeurs solides.14,15 De plus, un inhibiteur sélectif du BCL-XL offrait le potentiel de réduire les immunosuppresseurs.

effets sur la double inhibition de BCL-2 et BCL-XL.9,10. Un programme de développement d’inhibiteurs sélectifs

initiée dans le but immédiat d’identifier un composé approprié

pour les études clés in vivo. Auparavant, une série

d’inhibiteurs sélectifs du BCL-XL

contenant des noyaux d’hydrazinylbenzothiazole 1 ou 2 (figure ​ (figure1) 1) a été rapporté.16,17 L’optimisation a conduit à l’identification de WEHI-539 (3), qui a démontré la mort cellulaire sélective et basée sur le mécanisme

dans des cellules de fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) conçues pour être dépendantes

sur le BCL-XL par la perte de MCL-1 (mcl-1 – / –). 16 WEHI-539 a également démontré la destruction cellulaire dans la lignée cellulaire H146 du cancer du poumon à petites cellules humain (SCLC) dépendant du BCL-XL ( Figure ​ (Figure1) .1). Cependant, l’utilité de WEHI-539 comme molécule d’outil

était limitée par la présence d’une hydrazone labile et potentiellement toxique

moitié. De plus, les pauvres propriétés physicochimiques de cette

Composé rendu in vivo dosage intenable. Les efforts initiaux

pour reconcevoir les cœurs 1 et 2 à base d’hydrazone, a fourni un pharmacophore à base d’amide 4.18 Bien que 4

L’affinité BCL-XL par rapport à l’hydrazone parente

propriétés pharmacocinétiques (PK) acceptables chez le rat et ne

passif pharmaceutique.18 La génération

du composé 5 via l’extension dans le &#x0201c critique; P4 ”

poche de liaison a démontré que les analogues avec cible cellulaire sur

activité pourrait être obtenue, 18 cependant,

le manque de puissance dans la lignée cellulaire H146 de la tumeur humaine à barre plus élevée

qu’une optimisation supplémentaire était nécessaire.Figure 1Première génération à base d’hydrazone

Inhibiteurs du BCL-XL et

analogues de la deuxième génération à base d’amides. La poche de liaison P4 du BCL-XL

été

démontré être critique pour la liaison étroite des peptides BH3 et

inhibiteurs.6,7,16 Ainsi, nous avons ciblé

cette région pour nos efforts d’optimisation. Afin de faciliter la

identification de fragments productifs de liaison au P4 au-delà de la méthylamine

représenté dans WEHI-539,16 nous avons employé

une structure – relation d’activité (SAR) par fragment RMN

approche.19 Les structures cristallines du

Les coeurs d’hydrazone (1 et 2) et d’amide (4) avec BCL-XL ont démontré que ces molécules

lié la poche P2 de BCL-XL de manière très similaire et

pourrait donc être utilisé de manière interchangeable en tant que ligands du premier site.16 − 18 En conséquence, la solubilité légèrement plus élevée du noyau 1 dans les conditions aqueuses de l’expérience de RMN a suscité sa nomination.

en tant que premier site ligand. Pour identifier les ligands du second site, le criblage par RMN

a été entrepris (voir Information de support) avec une bibliothèque de 875 fragments hautement solubles en présence

de 1.Of les divers ligands de second site qui se lient

en présence de 1, l’hétérocycle bicyclique 6 (Figure 2) a démontré une bonne affinité (Kd ≈ 4 mM) avec de multiples vecteurs

pour l’attachement et la modification.

Six NOE de ligand protéinique observés dans un spectre 3D NOESY filtré au 12C et filtré au 13C ont ensuite été utilisés pour ancrer 6 dans la structure cristalline du BCL-XL lié à 1. Ce modèle a démontré que le groupe phényle de 6 était inférieur à 4 Å loin de l’acide picolinique (Figure ​ (Figure2), 2), indiquant qu’une petite attache pourrait être utilisée

pour relier les deux molécules. De plus, la proximité de la méta-

et para-positions de la fraction phényle de 6 suggéré

Ces vecteurs sont optimaux pour la liaison.Figure 2 Gauche: Très soluble

le fragment 6 identifié comme un 2e

liant de site par RMN en présence du noyau 1. Droite:

Structure ternaire dérivée de RMN de 1 (vert) et 6 (magenta) liée au BCL-XL. Un petit ensemble de composés (7 – 11, Tableau 1) avec des longueurs de liaison variables et

des points d’attachement ont ainsi été synthétisés pour explorer ces hypothèses.

La combinaison de para-substitution et d’une attache à 4 atomes a clairement émergé

comme l’optimum local par rapport à l’affinité BCL-XL, comme

le composé résultant (10) présentait une valeur Ki subnanomolaire tout en conservant une excellente sélectivité de liaison

(> 4000 fois) sur BCL-2. Cependant, comme prévu par le grand et

hydrophobe

nature du pharmacophore (MW = 688,8, ClogP = 6,2) et la présence

d’un acide carboxylique, l’addition de 1% de sérum humain (HS) au TR-FRET

conditions de dosage à droite déplacé les affinités de liaison apparentes de

tous les analogues d’environ 10 à 30 fois. Malgré cette atténuation

liaison, 10 ont montré une destruction cellulaire puissante dans mcl-1 – / – Cellules MEF en présence

de 10% de sérum fœtal bovin (FBS) .Table 1SAR de Fragment-Linked

AnaloguesaPour mieux comprendre la liaison

mode, une structure de cocrystal rayons X

de 10 lié au BCL-XL a été obtenu (1,8 Å

résolution, Figure ​ Figure3) .3). Le noyau du composé 10 a résidé dans la poche P2 comme prévu.16 − 18 Le cycle benzothiazole azote et proton amide formé le même

Liaisons hydrogène clés avec Leu108 et Ser106, respectivement, de la protéine BCL-XL comme observé avec les inhibiteurs à base d’hydrazone.16 De même, l’acide carboxylique de 10 a formé une liaison hydrogène avec la chaîne latérale de Arg139 au sein de la

protéine. Comme prévu à partir du modèle dérivé de la RMN, la phényl-1H-pyrazolo [3,4-d] pyrimidine liée

la poche P4 hydrophobe de BCL-XL, avec le phényle et

anneaux de pyrazole se trouvant à proximité des résidus hydrophobes

Tyr101 et Tyr195, respectivement. Figure 3 Structure cristalline à rayons X du composé 10 (vert)

à BCL-XL. La protéine est montrée comme un diagramme de ruban où la clé

les acides aminés sont colorés en orange, les atomes d’oxygène sont en rouge et l’azote

les atomes sont bleus. Les liaisons hydrogène clés sont représentées en pointillés rouges.

Code PDB: … Parce que le cycle pyrimidine de 10 a été exposé au solvant,

la contribution de cette fraction à l’affinité BCL-XL était

pas clair. Ceci a conduit à la synthèse et à l’évaluation de l’analogue 12 (Tableau 1), qui a conservé le pyrazole

anneau mais a manqué l’anneau de pyrimidine. Alors que 12 ont montré

affinité de liaison légèrement améliorée par rapport à 10, il

souffert d’une diminution substantielle de la liaison BCL-XL

en présence de 1% HS et une diminution de 10 fois de l’activité dans mcl-1 – / – Cellules MEF

comparativement à la pyrazolopyrimidine 10. Ces données suggérées

que le cycle pyrimidine de ce dernier composé conférait une réduction

dans la liaison protéique via l’augmentation de la polarité7 tout en ajoutant aucun avantage supplémentaire dans l’affinité de la cible.Pour

étendre cette hypothèse, le cycle pyrimidine de 10 était

ensuite utilisé comme échafaudage pour l’incorporation de groupes polaires.

Dans le cadre d’efforts d’optimisation antérieurs visant les inhibiteurs doubles du BCL-2 / BCL-XL, la liaison de la sérumalbumine humaine (HSA) a pu être allégée.

via l’incorporation de groupes amine à une position spécifique.6,7 En outre, la basicité du groupe amine pourrait être optimisée

pour compenser la partie acide du pharmacophore pour permettre substantiel

avantages dans la puissance cellulaire et l’absorption orale. Inspiré par cela

exemple, nous avons synthétisé une paire d’analogues avec des amines attachées en saillie

à partir de la fraction pyrimidine exposée au solvant (13 et 14, tableau 1).

l’ajout d’amines attachées a augmenté la cible

affinité des composés 13 et 14 relatifs

Cela a été illustré par les valeurs de Ki à BCL-XL, qui étaient en dessous des limites

de détection (10 picomolaire) dans le test TR-FRET et de façon spectaculaire

améliorée en présence de 1% de SH. L’affinité cible améliorée de 13 et 14 s’est traduite par des gains significatifs

activité cellulaire, avec les deux analogues montrant la mort très puissante

de mcl-1 – / – Cellules MEF (Tableau 1) .La présence de

la fraction pyrazole dans les analogues 10 semble conduire à une affinité cible

π -interaction des interactions dans la poche P4 de BCL-XL. Les amines attachées dans les analogues 13 et 14, à leur tour, ont été bénéfiquement bénéfiques dans la réduction de la liaison HSA

tout en augmentant simultanément l’affinité de la cible, bien que la raison

car ce dernier n’est pas clair compte tenu de la nature exposée au solvant de ces

moitiés. Ces observations conduisent à la conception et à la préparation de

aminoalkyne-linked 15 (Tableau 2), un analogue simplifié qui pourrait à la fois atteindre π -stacking

interactions ainsi que de réduire la liaison HSA. L’affinité de cet analogue

était encourageant, quoique légèrement inférieur à celui de 13 et 14. Cependant, l’excellente puissance de 15 contre mcl-1 – / – Les cellules MEF (EC50 = 8 nM) suggèrent une augmentation possible

dans la perméabilité, un résultat qui a été attribué à la basicité inférieure

de l’alkynyl amine terminale. Nous avons ensuite testé la capacité de 15 à tuer les cellules H146. Gratifiantement, en présence de 10%

HS, 15 a démontré une CE50 de 600 nM (Tableau 2). Tableau 2 Activité biologique

d’Alcyne 15 et Analogues HalogénésaAlkyne

l’analogique 15 était une structure de plomb attrayant

étant donné sa synthèse simple et sa masse moléculaire diminuée

(MW = 652) par rapport aux analogues de pyrazolopyrimidine 13 (MW = 789) et 14 (MW = 844). Le 4-alcynyle riche en électrons

fragment phénoxy a donc été ciblé pour une modification supplémentaire, avec

l’hypothèse que les halogènes pourraient créer des interactions supplémentaires

dans la poche hydrophobe P4 tout en conférant des effets bénéfiques sur

stabilité métabolique.20 À cette fin, un ensemble

d’analogues avec un seul halogène sur la position 2 ou 3 (16 – 18) ont été préparés en même temps que les 2,5-difluorés

analogue 19 (tableau 2). Dans tout

cas, l’halogénation du cycle phényle a augmenté l’activité cytotoxique

des analogues correspondants dans les cellules H146 par rapport à 15. Les analogues du fluor unique 17 (A-1155463)

et 18 en particulier a montré un environ 10 fois

boost dans l’activité de destruction de cellules.Une structure de coocristal de rayons X

de BCL-XL lié à A-1155463

(2.1 Å résolution, Figure ​ Figure4) 4) révélé

le substituant 2-fluoro devant être proche des chaînes latérales de Val141

et Phe97 dans la poche P4 hydrophobe. Ces proches C – F

distances (< 4.0 Å) ont suggéré la présence d'une camionnette

der Waals contacts.20Figure 4 structure en cristal à rayons X

de A-1155463 (vert) lié au BCL-XL. Les principaux acides aminés sont

orange coloré, les atomes d’oxygène sont rouges,

et les atomes d’azote sont bleus. Les contacts en pointillés sont < 4 &#x000c5 ;. PDB

code: 4QVX.A-1155463 a montré une liaison picomolaire

affinité pour les liaisons BCL-XL, et >

BCL-2 (tableau 2) et protéines apparentées BCL-W

(Ki = 19 nM) et MCL-1 (Ki > 440 nM). De plus,

l’activité cellulaire dans la cellule H146 dépendante du BCL-XL

ligne a été améliorée de près d’un ordre de grandeur par rapport à la

début de l’hydrazone WEHI-539. Parce que la solubilité aqueuse de cette

et les composés connexes compromis la génération de données ADME in vitro de qualité, nous avons choisi d’enquêter directement sur la

propriétés pharmacocinétiques de A-1155463 dans le roulement nontumor SCID-Beige

souris après une seule dose intrapéritonéale (IP). Comme le montre le tableau 3, une dose de 5 mg / kg a permis une couverture cible de 12

h par rapport à la H146 EC50, suffisante pour un

l’attente de l’activité in vivo.6 − 8Tableau 3 Propriétés pharmacocinétiques de A-1155463

dans SCID-Beige MiceaWe ensuite mesuré

les effets du A-1155463 sur les plaquettes, qui servent

en tant que biomarqueur commode pour l’inhibition du BCL-XL in vivo.8,9,11,12 Après une dose unique de 5 mg / kg IP de A-1155463

chez les souris SCID-Beige non tumorales, le nombre de plaquettes a chuté

mesurée à 6 h après l’administration, puis a rebondi à des niveaux normaux

72 h (Figure ​ (Figure5a) .5a). La cinétique des plaquettes

l’épuisement et le rétablissement étaient semblables à ceux précédemment rapportés avec

le double inhibiteur navitoclax.8 Pour fournir

preuve supplémentaire que A-1155463 conférait une activité in vivo cible, nous avons ensuite administré ce composé à

Souris SCID-Beige qui ont été inoculées avec BCL-XL-dépendant

H146 cellules tumorales. Une administration quotidienne de 5 mg / kg IP pendant 14 jours a causé

inhibition statistiquement significative de la croissance tumorale (tumeur maximale

inhibition de la croissance = 44%), qui a été atténuée après l’arrêt du traitement

(Figure ​ (Figure 55b). Figure 5 (a) Cinétique de réduction des plaquettes et

rebond après un seul

Dose IP de A-1155463 chez des souris SCID-Beige. Non-tumeur portant femelle SCID-Beige

les souris ont été traitées avec une dose unique de A-1155463 (5 mg / kg, IP). Du sang

les échantillons ont été recueillis au moyen de rétro-orbitale … En résumé, nous avons utilisé la conception basée sur la structure itérative pour générer

un inhibiteur BCL-XL très puissant et sélectif

dépourvue de la liaison labile hydrazone du composé d’outil précédent

WEHI-539. La capacité du A-1155463 à exercer in vivo l’activité cible a été démontrée grâce à une réaction rapide et réversible

réduction des plaquettes chez les souris SCID-Beige après une seule dose IP.

De plus, l’administration de A-1155463 à une tumeur SCID-Beige

les souris ont présenté une inhibition de croissance tumorale modeste mais statistiquement significative.

Études mécanistiques détaillées de A-1155463 et activité de combinaison

avec une chimiothérapie pertinente à travers plusieurs types de tumeurs seront signalés

dans un manuscrit d’accompagnement.