Évaluation clinique du test de sensibilité au médicament par observation microscopique pour la détection de la tuberculose

Contexte Il existe un besoin urgent de méthodes peu coûteuses pour la détection rapide et précise de Mycobacterium tuberculosis dans des échantillons cliniques Le test MODS de sensibilité aux médicaments à observation microscopique est une méthode de culture liquide relativement peu coûteuse et simple qui a été proposée pour utilisation dans les ressources. Cette étude prospective a évalué la performance du test MODS pour la détection de M tuberculosis chez les personnes subissant une évaluation de la tuberculose pulmonaire au Brésil et au Honduras. Les échantillons respiratoires ont été évalués par microscopie de frottis, culture sur milieu Löwenstein-Jensen et culture Un sous-ensemble de spécimens a également été cultivé en utilisant le système automatisé de croissance bactérienne Becton Dickinson Un sujet d’étude était considéré comme ayant la tuberculose si au moins la culture sur le milieu de Löwenstein-Jensen était positive pour M tuberculosisFindings Un total de spécimens respiratoires analysé sur un par-sujet ct, la sensibilité MODS était%% intervalle de confiance [IC], -, et la spécificité était%% CI, – Les temps médians à la détection étaient jours intervalle interquartile [IQR], – jours et jours IQR, – pour culture sur milieu Löwenstein-Jensen et pour le test MODS, respectivement P & lt; Pour les spécimens cultivés en utilisant le système automatisé MGIT, le temps médian de croissance était similaire pour les jours de dosage MODS; IQR, – jours et les jours du système automatisé MGIT; IQR, – jours; P = Le pourcentage de cultures contaminées était plus faible pour le test MODS que pour la culture sur milieu Löwenstein-Jensen% vs%; P & lt; Conclusions Le test MODS est un test relativement simple dont les bonnes caractéristiques de performance pour la détection de la tuberculose pulmonaire peuvent le rendre adapté aux environnements à ressources limitées

Il existe un besoin urgent de méthodes peu coûteuses pour le diagnostic de tuberculose TB La microscopie des frottis d’expectoration ne détecte que la moitié environ des cas de tuberculose pulmonaire positive pour la culture De plus, la microscopie des frottis d’expectoration est peu sensible chez les patients tuberculeux. Infection par le VIH ou SIDA, un groupe avec une forte mortalité par tuberculose à frottis négatif La culture mycobactérienne est plus sensible que la microscopie des frottis, mais les méthodes impliquant des milieux solides, par exemple le milieu Löwenstein-Jensen [LJ], présentent l’inconvénient d’être lente. des méthodes de culture liquide plus rapides ont généralement été jugées trop coûteuses pour une utilisation de routine dans des environnements à ressources limitées Le développement de nouveaux outils pour améliorer le diagnostic de la tuberculose, y compris la tuberculose à frottis négatif, a été considéré comme une priorité absolue. Organisation mondiale de la santé Le test MODS de sensibilité aux médicaments à observation microscopique est une méthode de culture liquide relativement peu coûteuse et simple. Le test MODS utilise des échantillons enrichis de Middlebrook H – milieu liquide et repose sur la détection microscopique de la croissance des cordons caractéristiques de Mycobacterium tuberculosis Les avantages potentiels du test MODS sont la croissance mycobactérienne relativement rapide et la confiance en compétences de microscopie similaires à celles utilisées pour la microscopie des frottis Caviedes et al. Dans une analyse rétrospective des échantillons de culture avec des résultats positifs par la méthode MODS ou la culture sur milieu LJ, la sensibilité rapportée du test MODS était de% et celle de la culture sur le milieu LJ était % Nous avons entrepris une étude prospective pour évaluer le test MODS pour la détection de M tuberculosis chez les personnes subissant une évaluation de la TB pulmonaire. Notre objectif principal était de déterminer la sensibilité diagnostique, la spécificité, la valeur prédictive positive et la valeur prédictive négative. [NPV] du test MODS pour la détection de la tuberculose chez les patients avec soupçonné pulmo Les objectifs supplémentaires de l’étude étaient de déterminer les performances diagnostiques du test MODS pour la détection de M tuberculosis dans les échantillons respiratoires et le temps de croissance de la tuberculose M.

Méthodes

ph, toux diminuée, et prise de poids de ⩾% du poids prétraitement en l’absence d’un autre diagnostic plausible; ou mort par tuberculose Un panel d’experts TB qui n’étaient pas impliqués dans l’étude a examiné les résultats du suivi et a classé chaque individu comme TB ou non TB Un consentement éclairé a été obtenu de tous les sujets Cette étude a été approuvée par les commissions d’examen institutionnel de Johns Hopkins Décontamination des échantillons respiratoires Les échantillons ont été digérés et décontaminés à l’aide de la méthode à la N-acétyl-L-cystéine-hydroxyde de sodium. ; La concentration finale d’hydroxyde de sodium était de% Les granulés ont été remis en suspension dans un volume final de mL et utilisés immédiatement pour l’inoculation des milieux de culture. Microscopie matricielle La coloration de Ziehl-Neelsen a été réalisée sur des spécimens concentrés. culture Le milieu MODS a été préparé en utilisant la base de bouillon Middlebrook H Becton Dickinson; g par L,% de glycérol, hydrolysat de caséine Sigma; g par L,% d’albumine-oléine-dextrose-catalase Becton Dickinson, et Panta Becton Dickinson, comme décrit précédemment Les concentrations finales antimicrobiennes étaient les suivantes: polymyxine B, U / mL; amphotéricine B, pg / ml; acide nalidixique, μg / mL; triméthoprime μg / mL; et azlocilline, μg / mL comme pour le système automatisé MGIT Pour chaque échantillon, mL de milieu MODS a été placé dans le puits d’une plaque de culture tissulaire stérile -well, et ensuite μL de l’échantillon décontaminé a été placé dans le puits. les sujets mais traités le même jour ont été étalés dans différents puits de la même plaque, et la plaque a été placée dans un sac en plastique perméable aux gaz. Chaque plaque a un contrôle négatif qui contenait du milieu MODS Les plaques ont été incubées à ° C en% CO. La croissance a été jugée positive si des pellicules ont été observées, négative si aucune pellicule n’a été observée, ou contaminée si des formes fongiques étaient présentes ou s’il y avait une croissance non codée dans les deux groupes. jours après l’inoculation La morphologie était classée comme positive si les pellicules avaient un aspect cordé ou négative si les pellicules ne présentaient pas d’aspect cordé. Une culture était considérée comme positive pour M tuberculosis si la croissance et la morphologie étaient positives Le technologue réalisant les tests MODS n’était pas au courant des résultats de culture LJ ou MGITCulture sur milieu LJ Les slants étaient préparés à partir d’une base de poudre Becton Dickinson et μL de chaque On a incubé des spécimens décontaminés sur chacune des pentes. Les paillettes ont été incubées à ° C dans le CO ambiant et examinées visuellement deux fois par semaine pendant plusieurs semaines. Une culture a été considérée comme contaminée si la croissance était négative pour les AFB. l’accumulation de niacine, et la production de catalase ° C ont été effectuées pour la désignation des espèces Pour un sujet individuel, la désignation de l’espèce a été effectuée sur la première culture positive sur le milieu LJ; si la culture était positive pour M tuberculosis, les cultures positives ultérieures étaient considérées comme positives pour M tuberculosis si les caractéristiques morphologiques et le temps de croissance étaient typiques pour M tuberculosisCulture utilisant le système automatisé MGIT La culture a été réalisée selon les instructions du fabricant pour le MGIT Système automatisé Becton Dickinson Le volume d’inoculation était de mL par tubeTest d’assurance qualité Chaque nouveau lot de milieu pour chacun des types d’analyse MODS, LJ et MGIT a été testé pour la stérilité et la croissance de M tuberculosis en utilisant une aliquote d’une souche de référence archivée. du milieu pour le test MODS a été testé pour la capacité à supporter la croissance avec M tuberculosis en tant que témoin positif et Mycobacterium avium en tant que contrôle négatifAnalyses Approximativement les cas de TB ont été calculés pour être sûrs que la vraie sensibilité du test MODS était dans les limites de% de la sensibilité estimée en supposant que ~% de patie Les tuberculoses présumées tuberculeuses auraient des résultats positifs pour M tuberculosis par culture sur milieu LJ, la taille de l’échantillon était constituée de patients suspects de tuberculose pulmonaire. L’analyse primaire de sensibilité, spécificité, VPP et VAN a été effectuée par sujet. a été réalisée sur une base par spécimen pour déterminer la concordance des résultats MODS avec ceux de la culture compagnon sur milieu LJ Une culture MODS avec croissance cordée a été considérée comme faussement positive si la culture LJ associée produisait une mycobactérie identifiée comme « non M tuberculosis » La comparaison entre les temps médians et la croissance a été effectuée par le test t de Student apparié. Le test de McNemar a été utilisé pour comparer des proportions appariées, et le test χ a été utilisé pour comparer les proportions non appariées de AP de & lt; a été considéré comme statistiquement significatif

Résultats

Sujets de l’étude et spécimens Un total de spécimens ont été collectés à partir de sujets. La figure montre un organigramme des sujets de l’étude. Neuf sujets n’avaient aucune culture réalisée sur le milieu LJ; ces sujets et leurs spécimens ont été exclus de l’analyse Les données ont été analysées pour les sujets et les échantillons testés à la fois par le test MODS et la culture sur milieu LJ

Figure vue grandDownload slide Diagramme de flux pour les sujets d’étude LJ, milieu de Löwenstein-Jensen; M tuberculose, Mycobacterium tuberculosis; MODS, test de sensibilité aux médicaments par observation microscopique; TB, tuberculoseFigure View largeTélécharger la diapositive Diagramme de flux pour les sujets d’étude LJ, milieu de Löwenstein-Jensen; M tuberculose, Mycobacterium tuberculosis; MODS, test de sensibilité aux médicaments par observation microscopique; TB, tuberculose Les caractéristiques démographiques et cliniques des sujets sont montrées dans le tableau Age moyen ± SD était ± ans ans, – ans Parmi les individus infectés par le VIH, les lymphocytes T médians et moyens CD étaient et cellules / mm, respectivement gamme, – cellules / mm Parmi les échantillons recueillis et évalués,% étaient des échantillons d’expectoration expectorés,% des échantillons d’expectoration induits et% des échantillons de lavage broncho-alvéolaire ou de lavage bronchique. Les nombres moyens et médians de spécimens par sujet étaient et respectivement

Tableau View largeDownload slideCaractéristiques des sujets de l’étudeTable View largeDownload slideCaractéristiques des sujets de l’étudePerformance diagnostique par sujet du test MODS Parmi les sujets,% ont reçu un diagnostic final de TB figure et tableau Comme indiqué dans le tableau, sensibilité, spécificité, VPP et VAN du Les tests MODS étaient% CI,% -%,%% CI,% -%,%% CI,% -% et%% CI,% -%, respectivement

Tableau View largeTélécharger la diapositive Comparaison de la susceptibilité aux médicaments d’observation microscopique Essai MODS avec culture sur Löwenstein-Jensen Milieu LJ pour la détection de la tuberculoseTable View largeTélécharger la diapositive Comparaison du test de sensibilité aux médicaments microscopique-observation MODS avec culture sur milieu Löwenstein-Jensen LJ pour la détection de tuberculose

Table View largeTélécharger slidePerformance du test de sensibilité aux médicaments pour la détection de la tuberculoseTable View largeDownload slidePerformance du test de sensibilité aux médicaments pour la détection de la tuberculoseTous les vingt-huit sujets étaient éligibles pour une évaluation de suivi de jour, car chaque ⩾ MODS résultat positif pour M tuberculose, mais aucune culture initiale sur LJ moyen positif pour M tuberculose Parmi ces sujets, reçu un diagnostic de TB sur la base des résultats de l’évaluation de suivi-jour tous les sujets avaient une réponse à la tuberculose, reçu un diagnostic alternatif de non-tuberculose, et un diagnostic d’infection mycobactérienne non mycobactérienne sur la base des résultats de tests biochimiques réalisés sur des isolats avec culture positive sur milieu LJ Un diagnostic définitif n’a pas pu être établi pour% des sujets, car ils ont été perdus de vue; à des fins d’analyse, ils ont été considérés comme n’ayant pas de TB à la tuberculose, avaient au moins un résultat de frottis positif pour les BAAR, et les autres étaient des frottis négatifs, sensibilité au frottis,%; % CI,% -% Le test MODS détecté de ces cas TB à frottis négatif% Sur une base par sujet, la spécificité du frottis, la VPP et la VAN étaient% IC%,% -%,%% CI,% -% et %% CI,% -%, concordance entre les échantillons de BAAR, le test MODS et la culture sur milieu LJ Parmi les échantillons,% avaient des résultats de frottis positifs pour AFB,% étaient positifs pour M tuberculosis par le test MODS, et% étaient positif pour M tuberculose par culture sur tableau de milieu LJ La concordance par spécimen pour le frottis et la culture sur milieu LJ était% IC%,% -%; Pour le test MODS et la culture sur milieu LJ, la concordance par spécimen était%% CI,% -% tableau Parmi les échantillons négatifs pour M tuberculosis par culture sur milieu LJ mais positif sur M tuberculosis par le test MODS, le milieu LJ Parmi les échantillons positifs pour M tuberculosis par culture sur milieu LJ mais négatif pour M tuberculosis par le test MODS, le milieu de culture MODS était contaminé en% et présentait pas de croissance en% Identification des espèces Un total de spécimens présentait une croissance mycobactérienne à la fois en culture sur milieu LJ et sur le test MODS. Parmi ces spécimens, la croissance sur milieu LJ a été identifiée comme M tuberculosis pour et non M tuberculosis Pour tous les spécimens dans lesquels M tuberculose a été identifié par culture sur milieu LJ, la culture MODS correspondante avait M tuberculosis identifié sur la base de la détection visuelle de la concordance de croissance cordée,%; Cependant, parmi les spécimens dans lesquels le mycobacterium cultivé sur milieu LJ a été identifié comme n’étant pas M tuberculosis, la culture MODS correspondante a développé une mycobactérie qui a été désignée comme n’étant pas M tuberculosis pour seulement des spécimens et comme M tuberculosis pour les spécimens. concordance,%; % CI,% -% Selon l’analyse par sujet, les individus% avaient ⩾ cultures sur LJ moyen positif pour une NTM et aucune culture sur LJ moyen positif pour M tuberculosis Pour% de ces individus, la croissance sur le milieu pour le test MODS était incorrectement identifié comme M tuberculoseCulture contaminée La proportion de cultures contaminées était plus faible pour les cultures MODS [%] d’échantillons que pour les cultures sur milieu LJ [%] des échantillons; P ⩽ Le pourcentage de cultures MODS contaminées n’était pas significativement différent entre les sites d’étude% pour le Honduras contre% pour le Brésil; P = La proportion de cultures contaminées sur le milieu LJ était% de cultures pour le Honduras et% pour le Brésil. P = Pendant les tests MODS, aucun des puits témoins négatifs n’a montré de croissance mycobactérienneTemps de croissance Figure montre les temps médians de croissance pour les spécimens positifs pour La tuberculose à la fois par culture sur milieu LJ et le test MODS Les durées médianes de croissance étaient les jours intervalle interquartile [IQR], – jours et jours IQR, – jours pour cultures sur milieu LJ et pour le test MODS, respectivement P & lt; Les temps médians de croissance en utilisant le test MODS étaient les mêmes jours pour les sites d’étude. Parmi ces échantillons positifs en culture, les cultures sur milieu LJ détectaient% d’échantillons positifs en quelques semaines, alors que le test MODS détectait% d’échantillons positifs en semaines P & lt; Le système automatisé MGIT a été utilisé pour tester un sous-ensemble de spécimens sur site. Pour les spécimens positifs à la culture pour M tuberculosis par culture sur milieu LJ, le test MODS et le test MGIT, le délai médian de croissance était similaire pour les tests MODS et MGIT jours [IQR, – jours] vs jours [IQR, – jours; P =; le délai médian de croissance sur le milieu LJ était de jours IQR, – jours

Figure View largeTableau Diagramme de la durée médiane de croissance de Mycobacterium tuberculosis pour chaque méthode de culture Les longueurs de boîte indiquent la gamme interquartile, les lignes horizontales dans chaque boîte représentent la médiane de la distribution et les moustaches s’étendent de la valeur minimale à la valeur maximale. , les résultats pour les échantillons positifs pour M tuberculosis à la fois par LJ et MODS sont montrés P & lt; Pour MGIT, les résultats pour les échantillons positifs pour M tuberculosis par LJ, MODS et MGIT sont montrés P = pour la comparaison de MODS et MGIT LJ, culture sur milieu de Löwenstein-Jensen; MGIT, système automatique d’indicateur de croissance mycobactérienne; MODS, microscopic-observation drug-susceptibility assayFigure View largeTélécharger Diagramme de la médiane de la durée médiane de croissance de Mycobacterium tuberculosis pour chaque méthode de culture Les longueurs de boîtes indiquent la gamme interquartile, les lignes horizontales dans chaque boîte représentent la médiane de la distribution et les moustaches à la valeur maximale Pour LJ et MODS, les résultats pour des échantillons positifs pour M tuberculosis à la fois par LJ et MODS sont montrés P & lt; Pour MGIT, les résultats pour les échantillons positifs pour M tuberculosis par LJ, MODS et MGIT sont montrés P = pour la comparaison de MODS et MGIT LJ, culture sur milieu de Löwenstein-Jensen; MGIT, système automatique d’indicateur de croissance mycobactérienne; La figure montre le temps de croissance par le statut de frottis AFB de l’échantillon source pour les échantillons positifs pour M tuberculosis par culture sur milieu LJ et le test MODS Pour les échantillons à frottis négatif, les temps médians de croissance étaient des jours pour la culture sur milieu LJ et jours pour le test MODS; la culture sur milieu LJ a détecté% de ces cultures positives en quelques semaines, alors que le test MODS a détecté% de ces cultures positives dans les semaines P & lt;

Figure View largeTélécharger slideTime à la croissance de Mycobacterium tuberculosis pour LJ et MODS, par bacilles acido-résistants AFB microscopie des frottis de l’échantillon respiratoire source Les résultats sont montrés pour les échantillons respiratoires à frottis négatifs AFB et les échantillons respiratoires à frottis positifs AFB qui étaient positifs pour M tuberculose par LJ et MODS LJ, culture sur milieu de Löwenstein-Jensen; MODS, microscopic-observation drug-susceptibility assayFigure View largeTélécharger slideTime à la croissance de Mycobacterium tuberculosis pour LJ et MODS, par bacilles acido-résistants AFB microscopie des frottis de l’échantillon respiratoire source Les résultats sont montrés pour les échantillons respiratoires à frottis négatifs AFB et AFB frottis- des échantillons respiratoires positifs qui étaient positifs pour M tuberculosis à la fois par LJ et MODS LJ, culture sur milieu Löwenstein-Jensen; MODS, test de sensibilité aux médicaments d’observation microscopique

Discussion

culture sur milieu LJ pour la détection de M tuberculosis dans les échantillons respiratoires, mais le temps médian de croissance et le pourcentage de cultures contaminées étaient significativement plus faibles pour le test MODS que pour la culture sur milieu LJ. En plus d’avoir des avantages par rapport à la culture sur milieu LJ, le test MODS présente des avantages par rapport à la microscopie des frottis, qui est le test de diagnostic de TB le plus largement utilisé dans les pays en développement. Étant donné que la TB pulmonaire à frottis négatif peut être transmissible et est associée à une mortalité élevée chez les personnes infectées par le VIH, une sensibilité accrue serait probablement bénéfique du point de vue de la santé publique et individuelle De plus, contrairement à la microscopie le test MODS peut être utilisé pour les tests directs de sensibilité aux médicaments Les résultats de cette étude ose d’une plus petite étude prospective de Caviedes et al qui a évalué les échantillons d’expectoration par le test MODS, culture sur milieu LJ, test avec le système automatisé MGIT, et une méthode H microagar; en utilisant comme standard de référence la détection de M tuberculosis par toute méthode de culture, la sensibilité du test MODS était de%, avec un temps de détection médian de jours. Dans une étude rétrospective plus récente, Moore et al ont analysé leur base de données. En utilisant la positivité de la culture par l’une ou l’autre méthode comme étalon de référence, les sensibilités du test MODS et de la culture sur le milieu LJ étaient respectivement de% et%, avec un temps de détection médian de jours pour le test MODS. L’évaluation n’a pas pu être complétée pour les sujets Cela a diminué notre capacité à déterminer si le résultat du test MODS était un faux positif ou si le résultat de la culture LJ était un faux négatif chez ces individus. était élevé Il est donc possible que la véritable spécificité et la sensibilité du test MODS pour le diagnostic de TB soient légèrement plus élevées que celles démontrées dans notre étude Ho En revanche, la sensibilité maximale du test MODS ne semble pas être sensiblement plus élevée que celle de la culture sur milieu LJ. D’autre part, nous ne pouvons pas totalement exclure la possibilité de contamination croisée entre les puits MODS car aucun des puits témoins négatifs résultats, il est improbable que la contamination croisée ait contribué à une proportion substantielle de cultures d’essai MODS positives. Les empreintes moléculaires de chaque isolat de M tuberculosis pourraient avoir éclairci ce problème mais n’étaient pas réalisables dans le contexte de cette étude. sa capacité relativement faible à discriminer M tuberculosis de NTM L’impact clinique de ceci dépendra de la prévalence de NTM parmi les individus évalués Dans notre étude, le rapport de sujets avec NTM aux sujets avec TB était bas, un scénario favorable au dosage MODS les sujets atteints de MNT pulmonaire, par rapport à la TB, diminueraient probablement la spécificité et la VPP du test MODS le long du Le PPV du test MODS pour la tuberculose était élevé chez les patients avec une probabilité élevée de pré-TB. Chez les sujets de notre étude, le taux de PPV du test MODS était plus bas si une plus faible proportion de sujets évalués TB dans notre étude. les caractéristiques de performance du test MODS étaient généralement similaires sur les sites d’étude, indiquant la faisabilité du transfert de technologie aux laboratoires ayant la capacité d’effectuer la culture sur milieu LJ. Cependant, le test MODS est plus difficile que la microscopie des frottis. Les défis potentiels liés au test MODS comprennent les suppléments de CO, le besoin de réactifs et de fournitures qui peuvent ne pas être facilement accessibles, la nécessité d’une technique méticuleuse pendant l’inoculation et la manipulation des plaques pour prévenir la contamination. , dépendance vis-à-vis d’un microscopiste motivé et risques biologiques associés à M tuberculosis gro aile en culture liquide dans des plaques nécessitant un transport de l’incubateur au microscope Cependant, certains des défis peuvent être surmontés sans mesures complexes ou coûteuses Modification de la plate-forme actuelle plaque dans une plate-forme plus sécurisée, par exemple, l’utilisation d’un couvercle hermétique pour réduire la De plus, les compétences en microscopie requises pour le test MODS sont généralement similaires à celles requises pour la microscopie des frottis, ce qui pourrait éventuellement s’appuyer sur la capacité existante dans les laboratoires où la microscopie des frottis est déjà effectuée ampoule. une méthode relativement simple et rapide pour le diagnostic de la tuberculose pulmonaire Son faible coût, par rapport à d’autres méthodes de culture liquide, peut rendre cette méthode utilisable dans les pays à ressources limitées .

Remerciements

Nous remercions Hilda Membreõo et Nery Almendarez du Laboratoire Central de Tuberculose Tegucigalpa, Honduras et Gisele Vieira de l’Hôpital Universitaire Clementino Fraga Filho de Rio de Janeiro, Brésil pour l’aide aux tests de laboratoire, Lygia Kitada pour l’aide au recrutement des sujets d’étude à l’Hôpital Universitaire Clementino Fraga Filho, Judith Hackman pour l’aide à l’analyse des données, et Dr Pina Maria Boquin pour avoir facilité l’étude à l’Institut national du thorax de Tegucigalpa, au Honduras. Les parrains de l’étude n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude; dans la collecte, l’analyse ou l’interprétation de données; ou dans la préparation des manuscrits. Soutien financier L’Initiative de lutte contre la tuberculose de Gorgas de l’Agence des États-Unis pour le développement international SGH A et les Instituts nationaux de la santé K AI à SED; K AI et U AI aux conflits d’intérêts RECPotential Tous les auteurs: aucun conflit