Scrub Typhus: La distribution géographique des variants phénotypiques et génotypiques de Orientia tsutsugamushi

Orientia tsutsugamushi est l’agent étiologique du typhus de brousse, une maladie fébrile aiguë transmise par les acariens qui sévit dans la région Asie-Pacifique. Historiquement, la caractérisation des souches a utilisé une analyse sérologique et révélé une diversité antigénique spectaculaire. Nous examinons la diversité géographique et les prévalences sérologiques et ADN L’analyse de l’ADN ainsi que l’analyse immunologique suggèrent que le prototype de souche Karp et les souches étroitement apparentées sont les plus communs dans la région d’endémicité Selon l’analyse sérologique, ~% des isolats sont séroréactifs aux antisérums de Karp. Les méthodes moléculaires révèlent une plus grande diversité Par des méthodes moléculaires, des souches phylogénétiquement similaires à Karp représentent ~% de tous les isolats génotypés, suivies par les souches du groupe génotype JG Japon, similaires sur le plan sérotypique à la souche Gilliam. Gilliam souche b ut génétiquement non-Gilliam; % de tous les isolats génotypés Trois autres groupes de génotypes apparentés à Kato, de type Kawasaki et de type TA représentent chacun ~% des isolats génotypés Les souches génétiquement similaires à la souche Gilliam ne constituent que% des isolats Les souches de ces groupes doivent être incluses dans vaccin potentiel

Les opinions et les affirmations sont les opinions personnelles des auteurs et ne doivent pas être interprétées comme officielles ou reflétant les vues du Département de l’Armée, du Département de la Marine, du Département de la Défense ou du Typhus de l’Université de l’Ohio. La maladie de tsutsugamushi ou, plus exactement, la rickettsiose à chigger est une maladie fébrile aiguë chez l’homme qui est causée par une infection à la bactérie Orientia tsutsugamushi suite à la piqûre de vecteurs d’acariens infectés Elle est endémique à une – ^ kmarea de le bord Asie-Pacifique, s’étendant de l’Afghanistan à la Chine, la Corée, les îles du Pacifique sud-ouest et le nord de l’Australie La transmission de l’agent étiologique à l’hôte rongeur ou à l’hôte accidentel survient chigger « stade des acariens principalement du genre Leptotrombidium La transmission verticale ou transovarienne semble être essentielle au maintien de l’infection dans la nature; Ainsi, l’acarien sert à la fois de vecteur et de réservoir. Les vecteurs peuvent être trouvés dans diverses conditions écologiques, des régions montagneuses du nord de l’Inde aux climats tropicaux de la péninsule malaise et de l’Indonésie. ou maladie non apparente à la maladie mortelle, avec des taux de mortalité variables rapportés dans la gamme% -% dans l’ère pré-antibiotique La maladie est historiquement significative; La preuve de la maladie a été trouvée dans des écrits datant de Chine et dans les descriptions postérieures des débuts du Japon. il a été décrit comme similaire au typhus transmis par les acariens au Japon [,,]

Figure Vue largeTélécharger la carte de la zone où le typhus exsudatif est endémique Les principaux vecteurs des régions sont donnés dans le tableau Les souches prévalentes d’Orientia tsutsugamushi dans des régions géographiques particulières sont répertoriées dans le tableau Figure Vue largeTélécharger la carte de la zone où le typhus est endémique les vecteurs pour les régions sont donnés dans le tableau Les souches prévalentes d’Orientia tsutsugamushi dans des régions géographiques particulières sont répertoriées dans le tableau

Tableau View largeTélécharger les diapositivesVecteurs vectoriels du typhus exfoliant humain et de leurs foyers géographiquesTable View largeTélécharger diapositivesVecteurs positifs du typhus exfoliant humain et de leurs foyers géographiques Bien que bien connu dans les domaines de l’endémicité, cette maladie n’est pas devenue plus familière à d’autres régions jusqu’à la Seconde Guerre mondiale. la maladie sur l’armée a culminé pendant cette guerre, quand des dizaines de milliers de cas et des centaines de morts ont été signalés parmi les troupes alliées et japonaises L’impact dramatique de la maladie dans le théâtre Asie-Pacifique de la guerre a et immédiatement après la guerre pour prévenir, contrôler et traiter la maladie Ce programme, coordonné par la Commission américaine Typhus, comprenait le développement de traitements, de nouveaux acaricides, l’imprégnation des répulsifs dans les vêtements, le contrôle environnemental par brûlage et nettoyage des zones de cantonnement. , et l’un des premiers essais de vaccins substantiels, mais finalement infructueux [, -] Malheureusement, la pertinence militaire de cette maladie a été douloureusement apprise encore & lt; années plus tard au cours du conflit du Vietnam, quand il a été rapporté que le paludisme est la deuxième cause de fièvre parmi les troupes dans le domaine [,,] Aujourd’hui, & gt; années après la fin de la Seconde Guerre mondiale, il n’existe toujours pas de vaccin humain efficace contre le typhus du scrub Un des résultats importants de la recherche de la Seconde Guerre mondiale a été la découverte de variations antigéniques spectaculaires entre les souches de tsutsugamushi. disponible en même temps, y compris la neutralisation croisée, la vaccination croisée, la vaccination croisée et la fixation du complément. En plus de la variation antigénique, la recherche a montré une grande variabilité intertincelle de la virulence chez les humains et les rongeurs allant de la maladie non apparente à la toujours mortel quand non traité À ce jour, il y a eu & gt; des souches antigéniquement distinctes rapportées, y compris les souches prototypiques initialement caractérisées Karp, Gilliam et Kato

DiapositivePrototypique et de référenceLes souches d’Orientia déterminées par antigénicitéTable View largeTélécharger les diapositives Protéotypiques et de référence Orientia comme déterminé par antigénicitéSoon après la Seconde Guerre mondiale, l’introduction de chloramphénicol et, plus tard, les tétracyclines éliminé dramatiquement et efficacement la mortalité parmi les cas reconnus assez tôt pour l’initiation de traitement Bien que les récidives ou les infections répétées étaient courantes , l’infection répondait généralement au traitement par les nouveaux antibiotiques, même lorsque des souches antigéniquement diverses étaient impliquées. Jusqu’à récemment, les efforts pour produire un vaccin efficace ont débuté immédiatement. après la Seconde Guerre mondiale a diminué dramatiquement, principalement en raison de l’existence de traitements antibiotiques efficaces et à action rapide. La nécessité de mettre davantage l’accent sur la prévention, comme le ferait un vaccin efficace, a été motivée par des preuves de plus en plus nombreuses de la présence d’antibiotiques. c réfractilité, la difficulté à diagnostiquer une maladie qui imite plusieurs autres maladies fébriles, et la popularité croissante de l’écotourisme dans les zones d’endémicité [,, -] Ces développements conduisent actuellement à de nouveaux efforts pour développer un vaccin, en particulier par le Département américain de la Défense. Les technologies modernes telles que les vaccins ADN , les protéines recombinantes et les vaccins combinés ADN-protéine semblent être des stratégies prometteuses pour la prévention des maladies, comme cela a été récemment suggéré ailleurs . Le manque de collecte systématique de souches et d’informations sur l’identification et la caractérisation des souches, en particulier sur les prévalences des souches, soulève la question de savoir quelles souches doivent être sélectionnées pour être incluses dans un vaccin ou un test diagnostique. intensif, nécessitant une sélection rigoureuse des souches représentatives L’objectif de cet article est d’examiner les données historiques sur la variation antigénique, y compris la caractérisation des isolats trouvés principalement chez les humains, et de résumer les informations génomiques sur les espèces Orientia qui pourraient guider la sélection des souches appropriées pour les tests diagnostiques ou les vaccins.

La nature de la variation de contrainte à O tsutsugamushi

La nature des antigènes multiples des souches Orientia a été examinée après que divers tests et outils de recherche de plus en plus sensibles ont été développés et sont devenus disponibles. Les espèces d’Orientia sont difficiles à cultiver et représentent un risque pour les chercheurs de laboratoire; Ainsi, l’isolement des agents pour le diagnostic et la caractérisation se fait principalement à partir de spécimens de sang humain ou de tissus de rongeurs. Des modèles pour l’isolement initial des souches Orientia le plus souvent impliquées chez les souris et la culture cellulaire, mais historiquement ont également inclus des lapins, des cobayes, des gerbilles et des hamsters Ces méthodes ont supposé une sensibilité du modèle suffisante pour isoler les souches humaines virulentes pour la propagation et l’analyse; cependant, la virulence peut varier considérablement entre les souches Orientia elles-mêmes et parmi les souches murines consanguines ou consanguines utilisées pour l’isolement [,, -] Même l’âge de l’hôte de la souris peut influencer la virulence apparente de la souche et la capacité à isoler l’agent in vivo. Bien que très limitée, il existe des preuves de différences de souche indiquées par la variation de la sensibilité aux antibiotiques ou aux antibiogrammes, liée à des rapports de typhus réfractaire aux antibiotiques [,,] Caractérisation antigénique directe des souches d’Orientia dans les aoûtats ou les marmelades infectées. Dans la méthode de collecte des plaques noires, des carreaux en plastique plats, carrés et noirs sont placés brièvement sur le sol. Questing, les aoûtats non attachés qui s’attachent aux plaques sont enlevés pour le rickettsiose. l’isolement chez les souris de laboratoire soit par inoculation intrapéritonéale ou par l’alimentation individuelle sur des souris immobilisées L’isolement peut également être fait en utilisant la culture cellulaire Une autre méthode de collecte consiste à éliminer les aoûtats des rongeurs piégés et à les traiter pour l’isolement de la souche Orientia et la caractérisation antigénique comme décrit ci-dessous. La différence entre les résultats de la méthode de la plaque noire de Chigger et ceux de la méthode L’utilisation de cette dernière méthode peut causer des difficultés d’interprétation, car les hôtes des rongeurs peuvent héberger des souches d’Orientia provenant de multiples apports de chigger, et ces souches peuvent être captées par des chiggers attachés. Méthodes de caractérisation sérologique Les caractérisations avec IFD ou IFA comprenaient des sérums humains et animaux et étaient basées sur des anticorps polyclonaux ou, plus récemment, monoclonaux souvent utilisés conjointement avec du sodium dodécal. sulfate de polyacrylamide g De manière significative, l’identification des souches – ainsi que l’établissement de la prévalence de la souche pour les différentes régions, vecteurs et réservoirs par l’utilisation de ces techniques sérologiques – nécessite une comparaison avec les «prototypes» établis disponibles au moment de l’analyse. Par exemple, la caractérisation précoce des FC n’a comparé que les souches Karp, Gilliam et Kato avec de nouveaux isolats , alors que les analyses IFA et DFA ont commencé à la fin de l’étude. Plus récemment, l’analyse génétique des gènes antigéniques des espèces d’Orientia, principalement mais non exclusivement sur l’antigène de surface des cellules-kDa, a inclus des souches thaïlandaises sélectionnées qui ont été montrées par CF, IFA et DFA. gène, a abouti à des techniques pour différencier les « génotypes » Ces méthodes moléculaires comprennent la PCR en conjonction avec le gel électrophorèse, cartographie RFLP polymorphisme de longueur de fragment de restriction, et le séquençage de produits de PCR spécifiques pour la comparaison directe des produits des mêmes gènes de multiples souches Orientia Il a également été utilisé électrophorèse D gel qui permet la comparaison protéomique de médicaments sensibles et – Les preuves de divergence dans d’autres séquences de gènes, par exemple, les gènes pour les protéines -kDa et la protéine -kDa HtrA commencent tout juste à être évaluées Toutes les séquences d’ADN des souches, la souche Boryong et la souche Ikeda, ont été Les séquences terminées et génomiques de la souche Karp, Naval Medical Research Center, Silver Spring, MD, et l’AFPL-Thai Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA sont en cours ou en voie d’achèvement GA Dasch et AL Richards, données non publiées Comme les séquences du génome entier des souches Orientia sont disponibles pour la comparaison et l’analyse, l’énorme portée de la variation de la souche deviendra probablement encore plus évidente ent, ce qui pourrait entraîner un intérêt accru pour l’état des espèces de souches du genre

Méthodes de caractérisation de la variation antigénique chez les espèces Orientia

Cependant, des études comparatives avec des tests CF ont montré que DFA était plus sensible pour la caractérisation des isolats que les techniques antérieures [,,] La caractérisation DFA des lignées infectées par Orientia dans les colonies d’acariens suggérait d’autres problèmes avec la méthode lorsque la variation antigénique intergénérationnelle a parfois été observée Par exemple, la génération d’acariens filiaux pourrait être négative pour la souche Gilliam par DFA, alors que la génération suivante dans la lignée pourrait être réactif. Les nouvelles méthodes moléculaires basées sur la PCR devraient éviter de tels résultats en raison de la plus grande sensibilité du test DJK, données non publiées. Contrairement au DFA, les tests IFA et immuno-peroxydase indirecte peuvent également être utilisés pour sérodiagnostic Le test IFA est réalisé en utilisant des échantillons de sérum de patient pour montrer Par exemple, Bozeman et Elisberg , utilisant IFA pour tester des échantillons de sérum provenant de patients malaisiens, ont montré une augmentation plus rapide du titre pour une infection homologue que pour une infection hétérologue. Le test d’immunoperoxydase indirecte est effectué de manière similaire; cependant, les points finaux sont observés en utilisant un microscope optique [,,] Bien que le test d’immunofluorescence indirecte ait longtemps été considéré comme l’étalon-or pour le sérodiagnostic, le manque de standardisation des points finaux et des souches antigéniques utilisées dans l’essai a entraîné confusion considérable Pour la caractérisation antigénique, le titre de sérum maximal dans les réactions avec un ensemble des souches prototypes Orientia est marqué comme le type antigénique Typage des anticorps monoclonaux Comme noté ci-dessus, les souches Orientia peuvent être difficiles à caractériser ou à classifier en utilisant DFA, IFA Pour réduire ce problème et produire des résultats plus spécifiques, certains chercheurs ont utilisé des anticorps monoclonaux développés à l’aide de souches prototypes Orientia pour caractériser des isolats d’humains, d’acariens et d’autres isolats de terrain [, ,, -] Des anticorps monoclonaux spécifiquement dérivés et réactifs avec les souches prototypes peuvent être utilisés pour classer de nouveaux isolats par plusieurs La spécificité associée à la caractérisation des anticorps monoclonaux est théoriquement très bonne, mais la multiplicité des souches uniques d’Orientia est problématique. Le développement d’anticorps monoclonaux à partir de chaque souche nouvellement identifiée. Parmi les souches apparemment uniques de comparaison avec chaque « prototype » précédemment identifié, il peut être impossible de réaliser un test d’immunoblot SDS-PAGE La réaction de protéines électrophorées provenant de multiples souches de rickettsies, isolées de nombreuses sources, avec des antisérums polyclonaux humains ou animaux. les anticorps monoclonaux montrent des différences dépendant des souches claires DJK et WMC, données non publiées O tsutsugamushi ne contient pas de lipopolysaccharide ou de glycoprotéines de membrane externe typiques de la plupart des organismes Gram négatif, et cette méthode donne au moins des protéines majeures, y compris -kDa, -kDa, -kDa, -kDa, -kDa et ~ – kDa prot eins La variabilité antigénique dramatique du scrotum typhus rickettsiae semble résider principalement mais pas exclusivement dans les protéines -kDa et -kDa Bien que les échantillons de sérum de la plupart des patients convalescents réagissent avec ⩾ de ces protéines majeures,>% réagissent avec un polypeptide dans la gamme de taille – kDa, avec SDS-PAGE montrant des profils antigéniques distincts parmi les souches pour cet antigène [, -] La protéine -kDa est devenue l’antigène le plus largement étudié, en particulier avec l’utilisation de SDS-PAGE. sur la surface cellulaire et contient à la fois des epitopes uniques et croisés réactifs La protéine -kDa est spécifique au type et la plus abondante protéine de surface cellulaire de O tsutsugamushi, constituée de ~ acides aminés, bien que la protéine puisse varier de ~ aux acides aminés dans différents souches On considère généralement que la protéine contient des domaines variables et qu’elle est l’antigène primaire qui reflète la variation à l’intérieur du genre On ne sait pas si la protéine joue un quelconque rôle dans pathogenèse de O tsutsugamushi, bien que l’on pense que la protéine agit comme un facteur d’adhérence de la bactérie à la surface de la cellule hôte , et peut être un déterminant de la virulence pour des souches individuelles . antigène pour les souches de typhus exfoliant et l’absence de similarité de séquence élevée du gène de l’ARN ribosomique de l’ARN ribosomique à partir des souches prototypes du typhus exfoliant par rapport à des séquences similaires pour diverses espèces de Rickettsia similarité,% ont servi de base pour l’élimination du typhus rickettsiae du genre Rickettsia et leur placement dans le nouveau genre Orientia

Figure Vue largeDownloade des acides aminés dans l’alignement de la région codante de la protéine -kDa d’Orientia tsutsugamushi La courbe montre la moyenne mobile, pour une fenêtre de résidus d’acides aminés, du nombre d’acides aminés différents observés à une position dans l’alignement des acides aminés pour & gt; Séquences complètes ou presque complètes des souches Orientia La localisation des domaines protéiques hautement variables VDI-VDIV dans l’alignement des acides aminés de la région codante est montrée au-dessus de la vue de la figure suivante: largeDownload slideDiversité des acides aminés dans l’alignement de la région codante du -kDa protéine d’Orientia tsutsugamushi Le graphique montre la moyenne mobile, pour une fenêtre de résidus d’acides aminés, du nombre d’acides aminés différents observés à une position dans l’alignement d’acides aminés pour & gt; séquences complètes ou presque complètes de souches Orientia La localisation des domaines protéiques hautement variables VDI-VDIV dans l’alignement des acides aminés de la région codante est montrée au-dessus du graphique

Caractérisation Moléculaire Des Gènes D’antigène Chez Les Espèces Orientia

directement, mais ils ont des limites Les premières études pour faire des comparaisons génétiques de souches ont introduit l’utilisation d’amorces PCR spécifiques à la souche, basées sur les séquences d’un certain nombre de souches prototypes Les échantillons ayant donné le produit ont été classés comme appartenant à un groupe identifié avec une souche prototypique particulière Cependant, la variation génétique existant dans le produit PCR mais en dehors des sites d’amorçage ne serait pas détectée, et l’amplification simple ne fournirait pas une estimation du degré de différenciation génétique. Dans de nombreux cas, les isolats pourraient être regroupés souches Par exemple, l’analyse avec des amorces prototypes spécifiques à la souche basées sur les séquences de gènes était capable de classer les souches isolées des échantillons de patients Cependant, on peut se demander si les échantillons sont négatifs. ou parce que le produit de souches divergentes n’a pas pu être amplifié en utilisant des amorces de PCR dérivées du prototype standard stra Une autre étape vers la détermination des niveaux sous-jacents de variabilité génétique dans le gène antigène-kDa au sein des populations utilise la caractérisation RFLP des produits de PCR Dans cette méthode, les endonucléases de restriction sont utilisées pour traiter les réactions PCR standard et nested amorces qui sont supposées amplifier toutes les versions du gène antigène-kDa Les modèles de bandes variables peuvent ensuite être comparés par électrophorèse. Le nombre de fragments générés pour la comparaison dépend du nombre et du type d’enzymes de restriction utilisés. fait pour relier la similitude génétique des souches aux propriétés antigéniques des isolats [,, -] Cependant, certaines souches ont montré des modèles uniques, et l’évaluation du degré de similarité dans de nombreux cas n’était pas simple [, -] Séquences génétiques du locus Protéine-kDa Les premiers rapports de la séquence du gène de ce locus indiquent que le produit protéique Un petit nombre de séquences a été comparé, et la quantité de différence génétique a été déterminée pour identifier les relations phylogénétiques entre les souches. La taille de la protéine a été jugée variable lorsque différentes souches ont été comparées. légèrement & gt; L’examen des séquences de gènes disponibles pour la protéine -kDa qui ont été déposées dans les bases de données de séquences par le milieu indique que les séquences protéiques codées par le gène peuvent être aussi Cette variation de longueur est le résultat d’un degré inhabituel d’insertion ou de délétion des nucléotides dans le cadre codant du gène qui maintient le cadre de lecture des protéines sans produire de signaux de terminaison prématurés. les régions du gène variable Le résultat final de ce processus est le niveau anormalement élevé de variation protéique et la diversité immunologique subséquente qui existe pour l’antigène spécifique au type-kDa. La comparaison entre souches prototypes indique que le gène présente plusieurs régions d’hypervariabilité. les régions primaires, désignées domaines variables VDI-VDIV , correspondent grossièrement aux régions de résidus hydrophiles la protéine Quand un plus grand nombre de séquences est comparé, ces domaines correspondent généralement aux zones de la protéine les plus sujettes à la divergence de séquence aux niveaux nucléotidique et protéique Comme la quantité de données de séquence disponibles pour la comparaison a augmenté, La diversité génétique dans ces portions de la protéine de domaine variable, par rapport à d’autres parties de la molécule, continue à être observée Ceci est illustré sur les figures et la figure présente le nombre moyen d’acides aminés différents avec une délétion considérée comme un acide aminé alternatif pour une fenêtre glissante des résidus d’acides aminés à travers la longueur alignée de la protéine pour les séquences Les domaines variables, tels que définis sur les premières séquences , ont été observés pour rester valables, compte tenu de l’ensemble de données plus grand Les régions VDI et VDII sont les plus variables. teneur en acides aminés La figure illustre les données avec l’utilisation d’une mesure de variabilité différente, la diversité génétique moyenne La diversité génétique dans le La même fenêtre glissante d’acide aminé à travers la protéine dans les séquences est illustrée Comme on le voit sur la figure, les domaines variables traditionnels contiennent le plus haut niveau de diversité au sein de la molécule. régions du gène Les deux figures et, cependant, montrent que des niveaux modérés de variabilité sont très répandus dans le gène, à des niveaux qui seraient considérés élevés dans la plupart des autres systèmes. Cependant, la diversité des formes représentée par la variabilité dans VDI-VDIV devrait être étant donné la considération critique dans tous les plans détaillés pour le développement de vaccins

La diversité génétique est définie par Nei et Kumar La courbe montre la moyenne mobile de la diversité génétique pour une fenêtre de résidus d’acides aminés. autour d’une position dans l’alignement des acides aminés pour & gt; Séquences complètes ou presque complètes de souches Orientia La localisation des domaines protéiques hautement variables VDI-VDIV dans l’alignement des acides aminés de la région codante est montrée au-dessus du graphiqueFigure View largeDownload slideDiversité des gènes mesurée au niveau des acides aminés dans l’alignement de la région codante de la protéine -kDa de Orientia tsutsugamushi La diversité génétique est telle que définie par Nei et Kumar Le graphique montre la moyenne mobile de la diversité génétique pour une fenêtre de résidus d’acides aminés autour d’une position dans l’alignement des acides aminés pour & gt; Séquences complètes ou presque complètes des souches Orientia La localisation des domaines protéiques hautement variables VDI-VDIV dans l’alignement des acides aminés de la région codante est montrée au-dessus du graphiqueArbres génylogéniques construits en utilisant des séquences d’ADN spécifiques dérivées des gènes de l’antigène-kDa de multiples souches Orientia Des comparaisons d’isolats du Japon, par exemple, ont produit des arbres phylogénétiques à partir de comparaisons de séquences qui ont été utilisées pour grouper le nombre croissant d’isolats d’humains, de rongeurs, et des acariens dérivés d’enquêtes épidémiologiques multiples dans les régions d’endémicité Des études similaires ont été réalisées à Taiwan , en Malaisie , en Inde , dans le nord de la Thaïlande et en Chine . Données de séquence d’ADN pour caractériser la variation interstraine Par milieu, la gamme de taille des séquences d’ADN, ~ à & gt; bases de & gt; Des isolats étaient disponibles pour comparaison. Approximativement la moitié de ces séquences déposées contient une partie substantielle de la région codante>% de la région codant pour la protéine nucléotidique. Récemment, cependant, pour des séquences déposées dans les bases de données de séquences internationales, il y a eu un mouvement vers l’obtention d’informations pour seulement – bases de la partie la plus variable du gène PAF, données non publiées Bien que ces fragments plus petits sont clairement utiles pour l’identification générale des types d’antigènes majeurs dans O tsutsugamushi, ils sont suffisants pour identifier complètement variation interstrain dans le Les séquences des bases de données internationales GenBank, European Molecular Biology Laboratory, et DNA Data Bank of Japan incorporant & gt; les bases du segment codant du gène ont été alignées de manière à éliminer les séquences identiques clairement redondantes pour les souches obtenues par plusieurs chercheurs des entrées, et ces entrées ont été complétées par des séquences non publiées, donnant des séquences de comparaison. Pour l’analyse phylogénétique, d’abord, un alignement a été obtenu en utilisant la traduction des protéines du gène comme base primaire d’alignement. Deuxièmement, la séquence nucléotidique a été utilisée directement comme base d’un alignement alternatif. des alignements alternatifs ont été construits en utilisant CLUSTAL W , comme implémenté dans le package d’analyse Mega La longueur de l’alignement diffère de la longueur biologique de la protéine ou du gène en raison de l’inclusion d’insertions nécessaires pour obtenir l’alignement final. séquences nucléotidiques alignées ont ensuite été analysées en utilisant la méthode de jointure voisine , o n Les arbres phylogénétiques ont été produits pour montrer les similitudes génétiques entre les souches L’arbre phylogénétique produit indirectement à partir d’un alignement des séquences protéiques différait de celui produit directement à partir des séquences nucléotidiques elles-mêmes en longueur de ramification seulement et topologie mineure, en particulier parmi les souches très proches, comme parmi les souches étroitement liées au prototype de la souche Karp La fiabilité du placement de ramification dans l’arbre a été évaluée à l’aide de bootstrapping L’identification des sous-groupes significatifs au sein de l’arbre phylogénétique de l’analyse topologique et des valeurs bootstrapL’examen des détails de l’arbre phylogénétique montre qu’il existe plusieurs clades identifiables parmi les séquences d’isolats d’Orientia évaluées dans notre étude. Schéma général des relations phylogénétiques entre isolats, obtenu à partir de l’analyse du nucléot direct. Les alignements d’ide, sont présentés dans la figure, qui ne tombent pas nettement dans n’importe quel clade majeur. Ces séquences peuvent représenter des groupes naturels très mineurs ou peuvent être le résultat d’une erreur de séquençage.

Figure Vue largeTéléchargement Diagramme Représentation schématique des relations phylogénétiques entre les principaux clades d’Orientia tsutsugamushi représentés par les séquences d’ADN du gène de l’antigène de surface -kDa La taille de chaque triangle représente approximativement la proportion de toutes les séquences complètes ou presque d’un clade. Les parenthèses à côté de chaque nom de clade représentent la fréquence parmi les séquences, y compris les séquences partielles. Les relations phylogénétiques détaillées sont montrées en figures et Figure Vue largeDownload slide Représentation schématique des relations phylogénétiques entre les principaux clades d’Orientia tsutsugamushi représentés par les séquences d’ADN de l’antigène de surface -kDa gène La taille de chaque triangle représente grossièrement la proportion de toutes les séquences complètes ou presque complètes d’un clade. Le pourcentage entre parenthèses à côté de chaque nom de clade représente la fréquence parmi les séquences, y compris les séquences partielles. Les relations phylogénétiques détaillées sont indiquées en chiffres et La relation détaillée entre les isolats est présentée dans la figure qui sont liés à la souche prototype Karp y compris les clades désignés Saitama, Kuroki, et TA des formes les plus éloignées montrées dans la figure sont listées par leur numéro d’accession GenBank, désignation de la souche et une indication de leur origine géographique Plusieurs études d’isolats d’Orientia au Japon ont précédemment identifié des groupements de souches sur la base des profils d’antigénicité et de RFLP [,,] Certaines des désignations de groupes montrées dans les figures sont basées sur celles présentées par Tamura et al. , suite aux études antérieures de ce groupe de recherche

orientation avec la figure KOR, Corée; JPN, Japon; RPC, République populaire de Chine; ROC, Republic of ChinaFigure View largeTélécharger l’arbre généalogique d’Orientia tsutsugamushi basé sur les séquences nucléotidiques du gène de l’antigène de surface cellulaire -kDa Un sous-ensemble de l’arbre phylogénétique est constitué des isolats les plus étroitement associés au clade comprenant la souche prototype Karp Les isolats sont identifiés par leur numéro d’accès GenBank, la désignation de la souche et une indication de leur origine géographique. L’arbre a été construit en utilisant la méthode de jointure voisine , sur la base du pourcentage de nucléotides. les données sont indiquées L’arbre entier donné sur cette figure et sur la figure est enraciné artificiellement au point de jonction des clades « divergents », y compris l’isolat prototype Shimokoshi, avec le reste des séquences L’arbre inclut la souche prototype Gilliam pour l’orientation avec la figure KOR , Corée; JPN, Japon; RPC, République populaire de Chine; ROC, République de ChineEn général, le clade ayant le plus grand nombre d’isolats sera appelé Karp-relatedfigure Ce clade comprend des souches très proches de celles trouvées pour le prototype de la souche Karp, ainsi que des séquences montrant une divergence mineure par rapport à celle-ci. de Karp mais qui maintiennent fondamentalement le cadre de lecture vu dans Karp Ces souches semblent inclure beaucoup de celles qui ont souvent été appelées « Karp-like » dans des études basées sur la similarité sérologique Certains isolats qui étaient étroitement liés au prototype de la souche Karp étaient L’analyse de séquence suggère que ces sous-groupes sont simplement de plusieurs sous-groupes étroitement liés les uns aux autres et liés au prototype de la souche Karp Les autres sous-groupes qui composent le Karp Les séquences liées aux Karp se trouvent dans l’ensemble du géographe. La répartition géographique de O tsutsugamushi, y compris le Japon, la Corée, la Chine et l’Asie du Sud-EstEgalement étroitement liée à Karp-relatedstrains en chiffres, mais plus distincte dans la séquence est le groupe Saitamaby Tamura et al sur la base du Japon. La valeur bootstrap pour le groupement de la Saitamaclade et du Karp-relatedgroup est%, indiquant une relation évolutive très significative rejoignant les groupes. En incorporant des informations sur la similarité de séquence à partir d’isolats pour lesquels seules des séquences partielles ont été rapportées, semble qu’un peu plus de% des séquences peuvent être considérées comme étant dans le clade représenté par Karp-relatedand Saitama Un second groupe de souches en plus divergent de la clade Karp est significativement associé comme mesuré phylogénétiquement par une valeur bootstrap de% Ce petit clade, désigné Kuroki, représente ~% des séquences dans les bases de données Cependant, sur la base de l’analyse, il peut être plus répandu dans certaines régions, notamment en Corée, que ne le représente le nombre de séquences disponibles pour l’analyse. Un groupe de souches plus variable dans la figure constitue le clade désigné TA, qui porte le nom de la souche prototype et qui constitue % de toutes les séquences Ce clade est clairement apparenté au cluster de Karp, Saitama et Kurokiclades mais avec une valeur bootstrap de soutien plus faible,% Isolates from the TAclade peut ne pas être présent au Japon ou en Corée mais à Taiwan et en Asie du Sud-est Gilliam est inhabituel car il fait partie d’un très petit clade qui est divergent des clades formé par la plupart des autres prototypes Peu d’isolats ont été observés qui partagent la similarité de séquence avec la souche prototype Gilliam Le prototype isolat Gilliam a été collecté en Birmanie Myanmar, et une souche avec une séquence similaire a été rapporté dans le nord de l’Inde Bakshi, séquence non publiée; Numéro d’accès GenBank DQ Il existe également un petit nombre de souches ayant des séquences similaires qui ont été trouvées en Mongolie Intérieure Les souches du type Gilliam constituent ~% des séquences d’Orientia dans les différentes banques de données En ce qui concerne les souches détaillées dans la figure, une autre Le regroupement de clades est constitué de séquences japonaises, désignées Kawasaki et JGby Ohashi et al JGrefers à « Gilliam type au Japon », sur la base de réactions croisées sérologiques Cependant, l’analyse des séquences indique que JG n’est pas, en fait, étroitement lié à Gilliam, tel qu’évalué par similarité de séquence Au lieu de cela, le JGclade semble clairement être lié à Kawasaki, et ensemble ils forment un groupe significatif séparé au sein des espèces Orientia Les types de séquence de Kawasaki, JG et un sous-groupe que nous désignons JG- La variante vJG représente le% de toutes les séquences Des séquences Kawasakitype ont été trouvées au Japon et en Chine, alors que les séquences JG et JG ont été observées au Japon, en Chine et en Asie du Sud-Est

Figure Vue largeTélécharger l’arbre généalogique d’Orientia tsutsugamushi basé sur les séquences nucléotidiques du gène de l’antigène de surface cellulaire -kDa Un sous-ensemble de l’arbre phylogénétique est constitué d’isolats associés aux clades avec une plus grande divergence de séquence des taxons liés à Karp. par leur numéro d’accès GenBank, la désignation de la souche et une indication de leur origine géographique L’arbre a été construit en utilisant la méthode de jointure voisine , sur la base du pourcentage de différences nucléotidiques. L’arbre entier donné dans cette figure et dans la figure est enraciné artificiellement au point de joignant les clades « divergents », y compris l’isolat prototype Shimokoshi, avec le reste des séquences L’arbre inclut la souche prototype Gilliam pour l’orientation avec la figure KOR, Corée; JPN, Japon; Nouvelle-Zélande, Nouvelle-Zélande; RPC, République populaire de Chine; ROC, Republic of ChinaFigure View largeTélécharger l’arbre généalogique d’Orientia tsutsugamushi basé sur les séquences nucléotidiques du gène de l’antigène de surface cellulaire -kDa Un sous-ensemble de l’arbre phylogénétique est constitué d’isolats associés aux clades avec une plus grande divergence de séquence de Karp taxa Les isolats sont identifiés par leur numéro d’accession GenBank, la désignation de la souche et une indication de leur origine géographique L’arbre a été construit en utilisant la méthode de jointure voisine , sur la base du pourcentage de différences nucléotidiques. les données sont indiquées L’arbre entier donné sur cette figure et sur la figure est enraciné artificiellement au point de jonction des clades « divergents », y compris l’isolat prototype Shimokoshi, avec le reste des séquences L’arbre inclut la souche prototype Gilliam pour l’orientation avec figure KOR, Corée; JPN, Japon; Nouvelle-Zélande, Nouvelle-Zélande; RPC, République populaire de Chine; ROC, République de ChineConsidération des chiffres et révèle qu’il existe d’autres clades très divergents des Karp, Saitama, Kuroki, Gilliam, Kawasaki et JGclades. Ils comprennent un ensemble de clades qui sont les plus proches du prototype de la souche Kato. : Kato-related, y compris Katoand Kt-vKato-variant en figure Un examen attentif de la figure révèle que le groupe apparenté à Kato est en réalité assez diversifié, tant génétiquement que géographiquement. Ce groupement représente ~% de toutes les séquences des bases de données. Quelques séquences hautement divergentes qui ne semblent appartenir à aucun des groupes que nous et d’autres avons désignés. Elles comprennent un petit groupe très divers et très divergent avec des séquences quelque peu liées à celle du prototype Shimokoshi Shimokoshi et d’autres isolats très divergents. seulement ~% de séquences et peut représenter des séquences d’organismes de la classification O tsutsugamushi qui à l’avenir peuvent être associés à un Espèces différentes Il ne semble pas y avoir de relation étroite entre le placement phylogénétique des souches sur l’arbre et leur potentiel pathogène. Sur la base de ces analyses moléculaires, il apparaît que pour qu’un vaccin soit «universellement» utile, il doit inclure des protéines. Des représentants des groupes KARP, Gilliam, Kawasaki, JG et Kurokigroups Comment intégrer les groupes les plus divergents est moins évident, bien que l’inclusion de Katoand Kt-v puisse être considérée. Le petit nombre de souches très divergentes, telles que Shimokoshi, indique La souche Shimokoshi a été signalée comme ayant une faible virulence dans les tests murins , de sorte que l’exclusion de ces souches divergentes pourrait ne pas être consécutive. Considérant l’origine géographique des souches pour lesquelles des séquences de nucléotides et d’acides aminés calculées ont été obtenues et la localisation de ces souches sur l’arbre en figure suggèrent qu’il n’y a qu’une légère évidence de différenciation géographique entre les souches. Des souches de régions divergentes, par exemple le Japon et la Thaïlande se retrouvent dans le même groupe phylogénétique, et aucun groupement phylogénétique ne semble être spécifique à une localité géographique, particulièrement étant donné la nature non aléatoire. de l’échantillonnage représenté par les souches qui ont eu des séquences déposées dans les bases de données de séquences internationales Cependant, bien que beaucoup des mêmes formes prototypes soient observées dans toute la gamme de O tsutsugamushi, des différences locales de fréquence peuvent et probablement se produire

Distribution géographique des types antigéniques

Comme indiqué dans l’introduction, la répartition du typhus des broussailles est une vaste zone géographiquement diversifiée de la région Asie-Pacifique. Les efforts pour classer les types antigéniques dans la région semblent être proportionnels à la stabilité politique et économique des pays où elle est endémique autant que Étant donné que d’autres maladies ont eu un impact plus important dans un grand nombre de ces pays, l’épidémiologie du typhus exfolié n’a été étudiée que récemment. Bien que des données sérologiques de caractérisation antigénique soient disponibles depuis plusieurs années, les données de caractérisation génétique devenir disponible seulement récemment La caractérisation antigénique et génétique est importante pour la sélection des vaccins candidats potentiels; Le tableau présente un résumé des résultats des enquêtes épidémiologiques plus étendues sur la prévalence qui ont utilisé l’une des méthodologies que nous avons examinées dans diverses régions géographiques. Les détails de ces études et d’autres études moins approfondies sont les suivants: présenté ci-dessous selon la région géographique

ghout Thaïlande a soutenu les résultats antérieurs, en ce sens que la souche Karp semble être prédominante%, ainsi que les souches «liées à Karp» TA%, TA% et TA% RFLP et la caractérisation génique du gène groEL pour & gt; isolats ont détecté des profils de bandes différents, et de ces modèles étaient spécifiques à une région De plus, les génotypes groel de type Karp semblaient manquer pour les isolats thaïlandais étudiés Plus récemment, Manosroi et al ont utilisé une PCR nichée Le gène de la protéine -kDa et le séquençage de l’ADN d’un fragment de paire-base pour isoler des patients ont été extraits d’échantillons de sang total prélevés chez des patients séropositifs atteints de typhus exfoliant qui se sont présentés dans des centres médicaux en Thaïlande. en Thaïlande, représentant% d’échantillons positifs, bien qu’un faible pourcentage de séquences semblables à Kato% ait été signalé dans le sud de la Thaïlande. La divergence des isolats de Thai Karp de la souche de type Karp était% régions d’endémicité moins étudiées. il y a plusieurs pays où le typhus des broussailles est avéré ou suspecté d’être endémique et les zones où des données limitées ont été ou sont récemment recueillies L’Indonésie est connue pour être une région où le typhus est endémique , principalement sur la base de la séropositivité pour le typhus exfoliant dans les échantillons de sérum humain. Cependant, on ne sait rien sur la prévalence des sérotypes ou des types de séquences. Shirai et Wisseman ont utilisé des isolats d’Orientia prélevés sur des patients, des rongeurs et des acariens répartis en plusieurs endroits à travers le Pakistan. La plupart des Souche Karp de virulence murine variable Bien que corroborant le fort pourcentage de souches Karp, la caractérisation tardive par DFA de ces isolats a identifié un pourcentage similaire de souches caractérisées comme réactives au conjugué TA Au nord montagneux, au Tadjikistan voisin, isolats des isolats de rongeurs isolés et d’acariens ont été sérotypés à l’aide de la mucoviscidose et ont été trouvés chez Gilliam seul En Ouzbékistan, une étude portant sur des patients atteints de fièvre aiguë a montré une séropositivité aux IgM contre les espèces Orientia avec l’utilisation d’un kit ELISA commercial. Cependant, aucune caractérisation de souche spécifique n’a été réalisée En Inde, le typhus a été reconnu comme une fièvre typhoïde dans et après foyers épidémiques On le trouve dans tout le pays et est signalé de façon saisonnière d’août à octobre, avec L deliense comme vecteur principal Pendant la Seconde Guerre mondiale, il était une cause majeure de fièvre parmi les soldats déployés le long de l’Assam-Inde-Birmanie. Frontière du Myanmar; Des cas ont été signalés tout au long de l’année dans la région, mais principalement d’octobre à décembre, et le taux de mortalité était de 100%. La souche prototype Gilliam humaine a été isolée à partir d’un soldat dans cette région. les cas sévères en temps de guerre ont typé les isolats comme Gilliam%, Karp%, Seerangayee% ou des souches mixtes% Mathai et al ont rapporté une épidémie dans l’état de Tamil Nadu dans le sud de l’Inde qui a eu lieu d’octobre à février cas et décès% ont été enregistrés Dix-sept patients ont rapidement présenté une déféction après avoir reçu un traitement à la doxycycline; cependant, le patient est décédé même si ce patient a reçu un traitement approprié. On ne sait pas si la résistance aux antibiotiques était impliquée dans ce cas, et aucune caractérisation antigénique, antigénique ou génétique n’est disponible dans cette épidémie. Dans une épidémie plus récente, Bakshi et al. PCR en temps réel avec PCR nichée en utilisant des échantillons de sang prélevés chez des patients fébriles dans les Etats de Himaschal Pradesh La PCR en temps réel s’est comparée favorablement à la PCR nichée; Les séquences réactives dans la PCR nichée étaient réactives dans la PCR en temps réel L’analyse des séquences d’isolats sélectionnés suggérait qu’elles étaient plus proches du prototype Kuroki Bien que n’étant pas une enquête épidémiologique, l’origine très disparate des échantillons de patients – du Nord au Sud de l’Inde – Il est clair que le typhus des broussailles a soudainement et dramatiquement réapparu aux Maldives, ~ km au sud-ouest de l’Inde, pendant l’été de . Des enquêtes ont révélé des cas et des décès. Sur l’île de Gadhdhoo seulement, des cas et des décès ont été rapportés Bien que les cas aient été confirmés par PCR, il n’y avait pas de description antigénique ou génotypique des souches infectantes. Au Sri Lanka, les cas sérologiquement confirmés ont été rapportés dans un mois. débutant en novembre, et un cas de typhus exfolié sérologiquement confirmé, acquis en portés dans un voyageur au Sri Lanka Cependant, ces cas n’étaient pas caractérisés antigéniquement

Discussion

Bien que la gravité de la maladie ait été quelque peu diminuée, l’immunité contre la souche hétérologue Orientia a été de courte durée, aussi courte que mois. Ceci suggère qu’un vaccin efficace devrait être multipotent Même quand un modèle murin a été utilisé, vaccins inactivés ou antisérums préparés De même, les singes feuille d’argent n’ont montré aucune résistance à une infection répétée par des souches homologues ou hétérologues à des mois . D’autres facteurs, outre la résistance de courte durée à une infection répétée hétérologue, sont également préoccupants. Une souche présentant une virulence humaine faible pourrait ne pas être envisagée pour l’incorporation dans un vaccin, en raison du risque réduit pour les personnes infectées, une souche présentant une virulence élevée et donc un risque plus élevé pourrait être envisagée même si sa prévalence était moins élevée. Japon avec des souches de tsutsugamushi maladie classique acquise par les agriculteurs travaillant le long des rivières de Niigata et n En plus de la virulence chez l’homme ou chez les primates non humains, la virulence murine est importante Bien que la corrélation de la virulence humaine et de la virulence murine soit problématique, la prépondérance de la virulence murine est importante. le modèle murin est encore couramment utilisé pour calculer les indices de protection vaccinale, ainsi que pour isoler les organismes du sang humain, des tissus et d’autres spécimens. De nombreuses études ont montré que la virulence de la souris dépend de la souche. souris consanguines, sélectionnées ou immunodéprimées, qui, bien que cette méthode soit sensible, pose la question de l’endémicité des souches d’Orientia pathogènes pour l’homme mais avirulentes chez la souris et donc facilement oubliées En fait, en utilisant la PCR nichée, Takahashi et al ont montré que les génotypes de chigger ne correspondaient pas nécessairement à la mu dérivée de l’extrait de chigger inoculé Dans le passé, la caractérisation antigénique de souches isolées d’Orientia a été réalisée principalement à l’aide de CF, un panel de réactifs DFA ou des tests IFA impliquant des anticorps monoclonaux prouvés dirigés contre des souches et des prototypes existants ou généralement acceptés, tels que décrits ci-dessus. Classification des isolats et souvent des souches identifiées Ces réactifs sont souvent mono-spécifiques, permettant le sérotypage clair de la plupart des isolats. Cependant, le fait est que de nombreux isolats de la zone d’endémicité sont réactifs à plusieurs conjugués. Cependant, ces méthodes peuvent prêter à confusion. résultats et n’ont pas permis aux chercheurs de déterminer si la réactivité croisée, c’est-à-dire la réactivité à plusieurs conjugués, résulte d’un mélange de types antigéniques dans l’isolement ou le résultat d’une seule souche présentant des épitopes variables. une sorte de purification de la plaque, une lente, labor-int En outre, les souches Karp et Karp-related prédominent dans de nombreuses études Bien sûr, la PCR en conjonction avec l’analyse de séquence des produits peut maintenant répondre à ces questions. Le génotypage par PCR et l’analyse de séquence permettent une comparaison rapide avec Toutes les séquences précédemment publiées de plusieurs souches à l’aide de GenBank peuvent également être comparées. Des réactifs spécifiques préparés de manière exhaustive sont nécessaires, et le besoin de facilités de BSL, nécessaire pour la plupart des travaux de propagation avec des organismes vivants Orientia, est évité. Bien que nous ayons passé en revue plusieurs études de prévalence ponctuelle, il est clair que les données de prévalence de la vaste région d’endémicité sont sporadiques et nécessitent beaucoup plus de précision grâce à la collecte et au test génotypique d’échantillons avec utilisation de Méthodes de génotypage à jour Néanmoins, quelques observations intéressantes peuvent être Par exemple, alors que les souches Karp, Karp et Gilliam semblent prédominer dans la région d’endémicité, de nombreuses études individuelles indiquent que la réactivité au conjugué TA est également courante dans la région. Le pourcentage de réactivité dépasse% dans au moins des études impliquant des isolats d’humains, de rongeurs et d’acariens dans plusieurs régions, y compris% en Malaisie ,% en Chine ,% aux Philippines ,% dans le North Queensland, Ces résultats sont essentiellement cohérents avec ceux des études génétiques réalisées dans ces régions. Figure Cela suggère que la souche TA, en association avec les souches Karp et Karp également prédominantes , pourrait être incorporé dans tout vaccin multivalent qui pourrait être produit. En tout état de cause, d’autres études épidémiologiques intensives sont nécessaires si nous voulons connaître la variance antigénique et la prévalence des souches de cette maladie grave. ase

Remerciements

Soutien financier Unité de travail du Centre de recherche médicale et de contrôle du matériel de l’armée américaine et du Centre de recherche médicale navaleRADJA; Cet article a été publié dans le cadre d’un supplément intitulé « Scrub Typhus: La distribution géographique des variantes phénotypiques et génotypiques de Orientia tsutsugamushi », parrainé par le US Army Medical Research and Material Command, Fort Detrick, Maryland Conflit d’intérêts potentiel Tous les auteurs: aucun conflit